Notch信号通路阻断剂对人脐带间充质干细胞软骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (23): 3609-3615.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.001

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Notch信号通路阻断剂对人脐带间充质干细胞软骨分化的影响

张家文¹，罗二梅¹，吴颜晖¹，符淑莹¹，陈丹纯¹，宇丽¹，唐明乔²

暨南大学，¹医学院生物化学系，²理工学院力学和土木工程系，广东省广州市 510632

修回日期:2014-04-24 出版日期:2014-06-04 发布日期:2014-06-04
通讯作者: 宇丽，博士，教授，暨南大学医学院生物化学系，广东省广州市 510632 并列通讯作者：唐明乔，工程师，暨南大学理工学院力学和土木工程系，广东省广州市 510632
作者简介:张家文，男，1988年生，广东省云浮市人，汉族，暨南大学在读硕士，主要从事软骨组织工程研究。
基金资助:
广东省自然科学基金资助项目(9151008901000050)；暨南大学大学生创新创业训练计划(Cx12200)

A Notch signaling pathway inhibitor affects chondrogenesis of human umbilical cord mesenchymal stem cells

Zhang Jia-wen¹, Luo Er-mei¹, Wu Yan-hui¹, Fu Shu-ying¹, Chen Dan-chun¹, Yu Li¹, Tang Ming-qiao²

¹Department of Biochemistry, Medical School of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; ²Department of Mechanics and Civil Engineering, School of Science and Engineering of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China

Revised:2014-04-24 Online:2014-06-04 Published:2014-06-04
Contact: Corresponding author: Yu Li, M.D., Professor, Department of Biochemistry, Medical School of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China Corresponding author: Tang Ming-qiao, Engineer, Department of Mechanics and Civil Engineering, School of Science and Engineering of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
About author:Zhang Jia-wen, Studying for master’s degree, Department of Biochemistry, Medical School of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 9151008901000050; Innovation and Entrepreneurship Training Program for Students in Jinan University, No. Cx12200

摘要/Abstract

摘要：

背景：Notch信号通路作为一条在细胞增殖和分化过程中起重要作用的信号通路，目前它在人脐带间充质干细胞在体外向软骨细胞诱导分化过程中的作用仍然未知。

目的：首次探讨Notch信号通路特异性阻断剂2，4-二氨基-5-苯噻唑(DAPT)对人脐带间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的影响。

方法：从人脐带中分离获得间充质干细胞，体外向软骨细胞诱导分化。实验分4组：①无诱导组换成含体积分数5%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基培养。②单纯诱导组换成终浓度为6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L转铁蛋白、10 μg/L转化生长因子β1、0.1 μmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、体积分数5%胎牛血清和1%双抗的软骨诱导培养基培养。③二甲基亚砜组在软骨诱导培养基中加入终浓度为0.1%的二甲基亚砜培养。④2，4-二氨基-5-苯噻唑组在软骨诱导培养基中加入终浓度为5 μmol/L的2，4-二氨基-5-苯噻唑(溶于二甲基亚砜)培养，二甲基亚砜终浓度为0.1%。

结果与结论：诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化后，细胞形态由长梭形变为多边形，且甲苯胺蓝染色和免疫荧光染色均呈现阳性；软骨诱导分化后Jag-1、PS-1、Notch-1、Hes-1的基因表达均明显下降(P < 0.01)；添加2，4-二氨基-5-苯噻唑后，与单纯诱导组相比，人脐带间充质干细胞中Jag-1、PS-1、Hes-1(P < 0.01)和Notch-1(P < 0.05)的基因表达显著降低；蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白含量均降低(P < 0.01)；蛋白聚糖的基因表达显著降低(P < 0.01)，Ⅱ型胶原蛋白的基因表达也出现一定程度的下降。提示Notch信号存在于人脐带间充质干细胞中，诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化后，这种信号强度迅速减弱；2，4-二氨基-5-苯噻唑可能通过Jag-1-Notch-1-Hes-1途径抑制人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 分化, 人脐带间充质干细胞, 软骨细胞, DAPT, Notch信号通路, 蛋白聚糖, Ⅱ型胶原蛋白, 甲苯胺蓝染色, 免疫荧光染色, qPCR, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Notch singling pathway is very important for cell proliferation and differentiation, but its role is still unknown during chondrogenesis of human umbilical cord mesenchymal stem cells.

OBJECTIVE: To investigate the effect of N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-(S)- phenylglycinet-butyl ester (DAPT) on inducing human umbilical cord mesenchymal stem cell differentiation into chondrocytes.

METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were isolated from human umbilical cord, then were induced to differentiate into chondrocytes. There were four experimental groups: non-induced group, high-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 5% fetal bovine serum and 1% double antibody; induced group, induced medium containing 6.25 mg/L insulin, 6.25 mg/L transferrin, 10 μg/L transforming growth factor beta 1,

0.1 μmol/L dexamethasone, 50 mg/L vitamin C, 5% fetal bovine serum and 1% double antibody; dimethyl sulfoxide group, induced medium containing 0.1% dimethyl sulfoxide; DAPT group, induced medium containing 5 μmol/L DAPT.

RESULTS AND CONCLUSION: After chondrogenic induction, the morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells became polygon and positive for toluidine blue and immunofluorescence staining; the expression of Jag-1, PS-1, Notch-1 and Hes-1 decreased significantly (P < 0.01). After the addition of DAPT, compared with the induced group, the relative gene expression of Jag-1, PS-1 and Hes-1 decreased markedly (P < 0.01), the relative gene expression of Notch-1 decreased obviously as well (P < 0.05), and the contents of proteoglycan and collagen type II proteins decreased significantly (P < 0.01). At the same time, the relative gene expression of proteoglycan decreased obviously (P < 0.05), and the relative gene expression of collagen type II decreased in part. Notch signaling pathway exists in human umbilical cord mesenchymal stem cells, once chondrogenesis begins, the signaling strength will decline rapidly. DAPT may prevent human umbilical cord mesenchymal stem cells from differentiating into chondrocytes by Jag-1-Notch-1-Hes-1 pathway.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, umbilical cord, chondrocytes, receptors, Notch

中图分类号:

R394.2

张家文，罗二梅，吴颜晖，符淑莹，陈丹纯，宇丽，唐明乔. Notch信号通路阻断剂对人脐带间充质干细胞软骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3609-3615.

Zhang Jia-wen, Luo Er-mei, Wu Yan-hui, Fu Shu-ying, Chen Dan-chun, Yu Li, Tang Ming-qiao. A Notch signaling pathway inhibitor affects chondrogenesis of human umbilical cord mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3609-3615.

图/表（结果） 2

2.1 各组人脐带间充质干细胞的形态观察 与无诱导组相比，诱导组、二甲基亚砜组和DAPT组的细胞形态由长梭形变为棱形、多边形，并出现聚集生长，类似于软骨细胞的形态特征，从形态上可以判断这几组的人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化成功(图1)。

2.2 蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的定性分析

甲苯胺蓝染色鉴定各组人脐带间充质干细胞的蛋白聚糖：与无诱导组相比，诱导组、二甲基亚砜组和DAPT组的甲苯胺蓝染色均呈现阳性，细胞被染成紫蓝色，表明这几组人脐带间充质干细胞的细胞质中有蛋白聚糖存在(图2)。

免疫荧光染色鉴定各组人脐带间充质干细胞的Ⅱ型胶原蛋白：与无诱导组相比，诱导组、二甲基亚砜组和DAPT组的免疫荧光染色均呈现阳性，细胞质中出现绿色荧光，表明细胞质中有Ⅱ型胶原蛋白的存在(图3)。

2.3 蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的定量分析

阿利新蓝法检测各组人脐带间充质干细胞的蛋白聚糖含量：与单纯诱导组相比，添加5 μmol/LDAPT后人脐带间充质干细胞细胞外基质中的蛋白聚糖含量明显下降 (P < 0.01)，说明DAPT对蛋白聚糖的表达有抑制作用，但诱导组和二甲基亚砜组之间的差异不明显(P > 0.05)，见图4A。

羟脯氨酸法检测各组人脐带间充质干细胞的Ⅱ型胶原蛋白含量：与单纯诱导组相比，添加5 μmol/L DAPT后人脐带间充质干细胞的Ⅱ型胶原蛋白含量明显下降(P < 0.01)，说明DAPT对Ⅱ型胶原蛋白的表达有抑制作用，但诱导组和二甲基亚砜组之间的差异不明显(P > 0.05)，见图4B。

2.4 实时定量荧光PCR检测相关基因的表达

软骨诱导分化前后Notch信号分子的基因表达：与无诱导组相比，诱导组人脐带间充质干细胞在软骨诱导分化后Jag-1、PS-1、Notch-1和Hes-1的基因表达均明显下降(P < 0.01)，说明Notch信号存在于人脐带间充质干细胞中，当人脐带间充质干细胞向软骨细胞诱导分化后，Notch信号表达下降(图5)。

添加DAPT后Notch信号分子的基因表达：与单纯诱导组相比，添加5 μmol/L DAPT后人脐带间充质干细胞中Jag-1、PS-1、Hes-1的基因表达明显下降(P < 0.01)，Notch-1基因表达也显著降低(P < 0.05)，说明了DAPT在人脐带间充质干细胞诱导分化后的信号水平上，进一步减弱了Notch信号(图6)。

添加DAPT后蛋白聚糖的基因表达：与单纯诱导组相比，添加5 μmol/L DAPT后蛋白聚糖的基因表达明显下降(P < 0.01)，说明了DAPT抑制蛋白聚糖的基因表达，但诱导组和二甲基亚砜组之间的差异不明显(P > 0.05)，见图7A。

添加DAPT后Ⅱ型胶原蛋白的基因表达：与单纯诱导组相比，添加5 μmol/L DAPT后Ⅱ型胶原蛋白的基因表达出现一定程度的下降，但诱导组和二甲基亚砜组之间的差异不明显(P > 0.05)，见图7B。

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引言

关节软骨组织由软骨细胞和细胞外基质组成，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白是关节软骨组织细胞外基质的主要成分，在体内起着重要作用^[1-2]。关节缺损及骨关节炎等原因造成的关节软骨损伤和退化是骨科常见的难题，给患者带来极大的痛苦和经济负担。虽然自体软骨细胞移植取得了比较满意的临床效果，但是软骨组织自我修复能力有限以及软骨细胞来源紧缺仍然是关节软骨损伤修复的主要障碍^[3-4]。软骨组织工程被认为是最有可能解决关节软骨损伤修复的方法，其中获得大量高效的种子细胞是软骨组织工程的关键^[5-7]。

间充质干细胞是一种广泛分布于人体内的未分化细胞，它在适当的诱导环境中可分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种组织细胞，是组织工程种子细胞以及临床应用研究的热点^[8-9]。近年来，国内外学者都致力于骨髓间充质干细胞的研究，并取得一定的成果，但骨髓间充质干细胞作为种子细胞来源有限，难以在体外大量扩增，且随着供者年龄增长其扩增和分化能力明显下降^[10]。人脐带间充质干细胞是从人脐带间质中分离获得的一种间充质干细胞，与其他来源的间充质干细胞相比，人脐带间充质干细胞具有以下的优势：来源丰富，不存在伦理道德问题，对供者无不良影响；移植后发生移植物抗宿主反应的风险低，可扩大供者范围^[11-12]。因此，人脐带间充质干细胞在组织工程方面的应用具有得天独厚的优越性。

Notch信号是一条在进化过程中高度保守的信号通路，在细胞增殖、分化、器官发育以及疾病发生中起重要作用^[13]。Notch信号分子Jag-1、PS-1、Notch-1和Hes-1均存在于哺乳动物细胞内^[14]，已有研究表明Jag-1介导的Notch信号在细胞分化和多种组织发育中起作用^[15-16]，并对人骨髓间充质干细胞的软骨形成起关键作用^[17]，Notch-1和PS-1在哺乳动物细胞中起重要作用^[18]，也对软骨形成初期起调控作用^[19]，Hes-1是与软骨形成相关的一个靶基因^[20]。

2，4-二氨基-5-苯噻唑(2，4-diamino-5- phenylthiazole；amiphenazole，DAPT)是Notch信号的特异性阻断剂，能特定地抑制γ分泌酶的作用，从而阻止Notch信号活化。目前国内外对人脐带间充质干细胞在体外软骨分化过程中的信号通路研究得比较少，而Notch信号在此分化过程中的作用仍然未知，实验采用单层细胞培养的方法在体外诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化，首次探讨DAPT对这个过程的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：分组对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2014年1月在暨南大学医学院生物化学系实验室及田家炳医学中心实验室完成。

材料：

人脐带间充质干细胞来源：本实验所用的人脐带间充质干细胞均从暨南大学第一附属医院妇产科当天剖宫产健康婴儿的新鲜脐带中分离获得，胎龄39至40周，无先天性疾病，产妇身体健康，产妇及其家属对脐带用于实验研究均知情同意，并经医院伦理道德委员会批准。

实验方法：

人脐带间充质干细胞分离培养及鉴定：采用酶消化法从人脐带中成功分离出间充质干细胞，培养及鉴定方法参考文献[21]的方法。

人脐带间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化：取第3代人脐带间充质干细胞，以2×10⁵/孔接种于6孔板中。待细胞达到90%融合时，分4组：①无诱导组换成含体积分数5%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基培养。②单纯诱导组换成终浓度为6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L转铁蛋白、10 μg/L转化生长因子β1、0.1 μmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、体积分数5%胎牛血清和1%双抗的软骨诱导培养基培养。③二甲基亚砜组在软骨诱导培养基中加入终浓度为0.1%的二甲基亚砜培养。④DAPT组在软骨诱导培养基中加入终浓度为5 μmol/L的DAPT(溶于二甲基亚砜)培养，二甲基亚砜终浓度为0.1%。各组分别诱导18 d，每3 d换1次液，倒置显微镜下观察并拍照。

甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖：诱导18 d后，弃去六孔板中的培养基，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min。PBS洗涤3次，0.1%甲苯胺蓝工作液常温染色30 min。弃去染料，蒸馏水冲洗干净，倒置显微镜下观察并拍照。

免疫荧光染色鉴定Ⅱ型胶原蛋白：诱导18 d后，弃去六孔板中的培养基，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定 10 min。PBS洗涤3次，用0.5%TritonX-100对细胞透化处理10 min。PBS洗涤3次，0.5% BSA室温封闭30 min。PBS洗涤3次，一抗4 ℃孵育过夜(稀释比例为1∶120)。PBS洗涤3次，二抗室温避光孵育60 min(稀释比例为1∶80)。PBS洗涤3次，荧光倒置显微镜下观察并拍照。

蛋白聚糖的含量测定：诱导18 d后，取各组细胞上清200 μL，加入40 μL木瓜蛋白酶消化24 h；加入100 μL 8 mol/L盐酸胍和750 μL 0.25%阿利新蓝溶液，4 ℃反应 1 h；12 000 r/min离心15 min，弃上清，加入150 μL异丙醇溶解沉淀，600 nm波长处测定吸光度值。以一系列浓度梯度的硫酸软骨素标准液制作标准曲线，将吸光度值代入标准曲线求得蛋白聚糖含量。

Ⅱ型胶原蛋白的含量测定：诱导18 d后，取各组细胞上清250 μL，加入羟脯氨酸消化液50 μL，加入羟脯氨酸反应液2 mL，60 ℃水浴15 min，冷却后3 500 r/min离心 10 min，取150 μL上清，560 nm波长处测定吸光度值。以一系列浓度梯度的羟脯氨酸标准液制作标准曲线，将吸光度值代入标准曲线求得Ⅱ型胶原蛋白含量。

实时定量PCR检测基因表达：诱导18 d后，提取各组人脐带间充质干细胞总RNA，以300 ng总RNA量反转录成cDNA。实时定量PCR反应体系如下：SYBR qPCR Mix 10 μL，上下游引物各3 μL，cDNA 4 μL；反应条件如下：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，Tm 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环。数据分析采用ΔΔCt法，即相对表达量=2^-^ΔΔCt= 2^-^(ΔCt^实验组^-^ΔCt^诱导组⁾=2^-^[(Ct^实验组^-^Ct^内参⁾^-^(Ct^诱导组^-^Ct^内参^)]。所用引物序列见表1。

主要观察指标：①各组人脐带间充质干细胞的形态变化。②甲苯胺蓝染色和免疫荧光染色的异染情况。③蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的含量测定。④Notch信号分子和蛋白多糖与Ⅱ型胶原蛋白的基因表达。

统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据均用x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前对组织工程种子细胞的研究主要集中在诱导条件的优化上，而对其分化过程的分子机制研究甚少，成为制约软骨组织工程进一步发展的瓶颈^[22]。Notch信号通路作为生物进化和器官发育过程中一条极其保守的信号通路，它通过Notch受体与配体结合、Notch受体的酶切活化、可溶性Notch胞内段转移到细胞核并与CSL DNA结合蛋白相互作用，最终调控靶基因的表达^[23-24]。研究表明，Notch信号在成骨分化^[25]、心肌细胞的生长与分化^[26-27]、神经干细胞的增殖与分化以及人脂肪间充质干细胞的脂肪形成等过程中起作用^[28-29]，并参与调控人的软骨发育和软骨细胞的增殖与分化^[30-31]，也有研究表明Notch信号干扰鸟类的软骨发育^[31]。

本实验采用单层细胞培养的方法诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化。结果显示，与无诱导组相比，各实验组人脐带间充质干细胞的细胞形态由长梭形变为棱形、多边形，且细胞外基质中出现蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白，表明在添加DAPT后人脐带间充质干细胞仍能被诱导分化为软骨细胞，但定量分析结果显示其蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白含量远远低于单纯诱导组，说明DAPT抑制了蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白合成。实时定量荧光PCR结果显示，在软骨诱导分化后，人脐带间充质干细胞的Notch信号分子基因表达均明显下降，证明Notch信号存在于人脐带间充质干细胞中。添加DAPT后，与单纯诱导组相比，Jag-1、PS-1、Hes-1和Notch-1的基因表达均显著降低，且蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的基因表达也低于单纯诱导组，提示使用DAPT进一步减弱Notch信号会抑制蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的基因表达，这可能与SOX9转录因子的调控有关^[32-33]。另外，无论是Jag-1、PS-1、Notch-1、Hes-1的基因表达，还是软骨特异性基质产物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的基因表达与含量检测，单纯诱导组和二甲基亚砜组之间都没有显著差异，表明低浓度的二甲基亚砜对人脐带间充质干细胞形成软骨细胞的影响微乎其微。

综上所述，实验证明Notch信号存在于人脐带间充质干细胞中，一旦诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化，这种信号强度迅速减弱；DAPT可能通过Jag-1-Notch-1-Hes-1途径阻止人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化。由于时间所限，本实验只是对DAPT这种效应的分子机制进行了初步的研究，因为Notch信号通路中还存在其他种类的配体、受体和靶基因，且软骨形成过程中还受到其他信号通路的影响^[34-35]，因此是否存在其他种类的配体、受体或靶基因与Jag-1-Notch-1-Hes-1途径共同起作用，或者其他信号通路与Notch信号是否共同起作用，需要作进一步的探讨和研究。

Notch信号通路阻断剂对人脐带间充质干细胞软骨分化的影响

A Notch signaling pathway inhibitor affects chondrogenesis of human umbilical cord mesenchymal stem cells

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